广盛网 Star-Oddi数据记录器尽管对蝙蝠肠道上皮有明显的趋向性，但埃及红蝠对呼吸道挑战的易感性增加_病毒_研究

越来越多的证据表明蝙蝠是大多数冠状病毒的祖先宿主。一般来说，冠状病毒主要针对胃肠道系统，而一些菌株，尤其是最具代表性的 SARS-CoV、MERS-CoV 和 SARS-CoV-2 等 Betacoronavirus，也会导致人类和其他哺乳动物出现严重的呼吸道疾病。我们之前曾报道过Rousettus aegyptiacus（埃及果蝠）对鼻内 SARS-CoV-2 感染的易感性。在这里，我们通过评估病毒脱落、宿主免疫反应、组织特异性病理学和生理参数，比较了它们对口腔感染和呼吸道感染（鼻内或口气管内）的耐受性。虽然 1 × 10^(4)TCID50 中等感染剂量的呼吸道攻击会导致口腔和鼻腔脱落具有复制能力的病毒广盛网，但口服攻击仅诱导鼻腔脱落低水平的病毒 RNA。即使在 1 × 10^(6)TCID50 更高感染剂量的攻击后，在任何口服攻击的蝙蝠样本中都未检测到具有复制能力的病毒。我们推测 SARS-CoV-2 被 HCl 灭活并被 R. aegyptiacus 胃中的胃蛋白酶消化，从而降低了口服感染的效率。因此，粪便脱落的 RNA 似乎取决于呼吸道感染时的全身传播。这些发现可能会影响我们对蝙蝠冠状病毒感染病理生理学的总体理解。

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一、引言

自 2019 年末以来，严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）已导致超过 7.75 亿人感染，超过 700 万人死亡。虽然该病毒主要在人类呼吸道内复制，但 SARS-CoV-2 也可以在胃肠道定植，并可能造成严重损害。尽管 SARS-CoV-2 的起源仍未完全阐明，但在蝙蝠中反复检测到与之密切相关的 β 冠状病毒序列，这突出了蝙蝠作为 SARS-CoV-2 自然宿主的潜在作用，以及病毒传播给人类的风险。

蝙蝠一直被报道为多种人畜共患病毒的自然宿主，如包括狂犬病病毒在内的狂犬病毒属、马尔堡病毒和亨尼帕病毒。有趣的是，在 2003 年 SARS-CoV 疫情之前，人们并不知道蝙蝠携带冠状病毒（CoV），这可能是由于对蝙蝠的监测有限。从那时起，在全球众多蝙蝠物种中检测到越来越多的冠状病毒，包括美洲、非洲、亚洲、大洋洲和欧洲的蝙蝠。蝙蝠甚至被认为是一些 α 和 β 冠状病毒的祖先宿主，这些病毒如今与其他哺乳动物宿主相关。在蝙蝠野外样本中，粪便标本或肛门拭子大多成功检测到 α 和 β 冠状病毒，这表明这些病毒对这些物种的胃肠道可能具有偏好性嗜性。虽然在口腔拭子野外样本中也检测到冠状病毒 RNA，但配对的粪便样本在测序时读取长度更长、覆盖范围更广，或者与口腔拭子相比，RNA 阳性率更高。最近有报道称，一种 β 冠状病毒对食虫蝙蝠 Nathusius's pipistrelle（Pipistrellus nathusii）的肠道上皮和潜在结缔组织具有嗜性。菊头蝠是包括 SARS-CoV 在内的多种菊头蝠病毒（β 冠状病毒属中的菊头蝠病毒亚属）的自然宿主，它们也被认为是 SARS-CoV-2 的自然宿主。此外，这些蝙蝠还可能促进不同地理位置的冠状病毒株之间的共同感染和重组事件。本研究中使用的埃及果蝠（R. aegyptiacus）属于狐蝠科，据报道，该科成员携带多种病毒，包括冠状病毒科、副粘病毒科、呼肠孤病毒科和丝状病毒科的病毒，其中包括马尔堡病毒。

研究人员先前报道，埃及果蝠对鼻内接种 SARS-CoV-2 敏感，并且能在其呼吸道中短暂支持病毒传播，但没有表现出疾病迹象，也没有有效地将病毒传播给接触动物。基于这些结果，研究人员对该物种下呼吸道和胃肠道在 SARS-CoV-2 感染中的作用提出了疑问。因此，研究人员通过评估生理参数、病毒排出、宿主免疫反应和病理变化，比较了鼻内、经口气管和口服感染途径的效率。由于研究人员之前的研究表明，鼻内接种后病毒仅在鼻腔和气管上皮中传播，因此选择经口气管接种途径来研究下呼吸道是否对 SARS-CoV-2 感染具有易感性，因为接种途径会影响病毒最初的复制部位。在许多其他冠状病毒中，SARS-CoV 及其近亲 RaTG13 都在菊头蝠的粪便拭子中被检测到，并且 SARS-CoV-2 已被证明能够感染中华菊头蝠来源的肠道类器官。这些发现表明，这些病毒在蝙蝠中对胃肠道组织具有嗜性，这促使研究人员在本研究中纳入口服感染途径。然而，目前尚不清楚胃肠道感染是在摄入病毒后直接发生，还是由全身传播导致的。由于细胞受体的存在和分布在 SARS-CoV-2 嗜性中起着重要作用，并且已证明菊头蝠的小肠上皮表达细胞受体 ACE2 以及蛋白酶 TMPRSS2，因此后者似乎非常有可能。然而，来自 Leschenault's rousette（Rousettus leschenaultii）和 Jamaican fruit bat（Artibeus jamaicensis）的肠道类器官对 SARS-CoV-2 具有抗性。为了更好地了解 SARS-CoV-2 病毒粒子在埃及果蝠胃肠道中的命运，研究人员首先测定了胃肠道不同部位的 pH 值，因为这些数据在文献中并不充分。研究人员还分析了 SARS-CoV-2 病毒粒子在酸性环境中的稳定性以及它们对胃蛋白酶消化的敏感性。

此外，研究人员分析了感染和未感染蝙蝠不同组织中的免疫反应。干扰素（IFNs）作为控制宿主抗病毒状态的关键细胞因子，分为三个不同的组，分别称为 I 型、II 型和 III 型干扰素。在大多数哺乳动物中，包括 IFNα 和 IFNβ 在内的 I 型干扰素在病毒感染时由多种细胞类型产生。然而，研究表明，在黑狐蝠（Pteropus alecto）中，即使在没有病毒感染的情况下，IFNα 也会组成性表达。研究人员还量化了 IFNγ 的表达水平，IFNγ 是一种 II 型干扰素，对宿主抵御细胞内病原体至关重要，主要由淋巴细胞产生。与 I 型和 II 型干扰素类似，III 型干扰素可以限制 SARS-CoV-2 的复制，并在 SARS-CoV-2 感染期间诱导肺组织损伤。因此，研究人员在本研究中也评估了埃及果蝠中 III 型干扰素的表达。

除了经典的病毒学、免疫学和组织病理学分析外，本研究还包括通过腹腔植入的数据记录器监测生理参数，包括体重、体温和运动活动。此外，研究人员使用双标水（DLW）方法测量了能量消耗。研究人员认为这种广泛的研究方法至关重要，因为蝙蝠作为野生动物，通常不会表现出明显的临床症状，这使得对实验感染的解释具有挑战性。

这种方法使研究人员能够全面评估埃及果蝠中的 SARS-CoV-2 感染情况，并揭示 SARS-CoV-2 在该物种中的组织嗜性，特别是在胃肠道中的嗜性。这种方法可以应用于研究蝙蝠中的其他冠状病毒感染。更好地了解不同感染和传播途径的作用，将有助于评估和管理其他可能从蝙蝠传播到其他哺乳动物的人畜共患病毒溢出事件。

二、材料与方法

所有感染性实验均在生物安全三级（BSL - 3）实验室和动物设施中进行。

01. 细胞、病毒和数据可用性

Vero E6 细胞取自 FLI 兽医学细胞培养物保藏中心。SARS-CoV-2 分离株 2019_nCoV Muc-IMB-1（登录号 LR824570）。该病毒的完整基因组可在 GISAID 上获取：EPI_ISL_406862。病毒在添加 2% 胎牛血清（FCS）的 DMEM 培养基中，于 Vero E6 细胞中进行培养和保存。在用于动物研究之前，按照之前报道的方法对病毒序列进行了验证，并做了一些修改。

02. 病毒滴定

使用 96 孔板中 80 - 90% 汇合的 Vero E6 细胞，对本研究中收集的病毒原液和样本（拭子样本、鼻腔灌洗液样本、组织样本）进行滴定，并按照之前描述的方法测定 50% 组织培养感染剂量（TCID50）。使用 Spearman 和 Kaerber 方法计算滴度。

03. 埃及果蝠攻毒实验

从 FLI 的埃及果蝠繁殖群体中随机选取雄性和雌性果蝠，分为每组 6 只动物的研究组。动物以三只一组的形式饲养在 75×130×65 cm 的笼子中。所有动物均可自由获取水和新鲜水果。每天监测临床评分（姿势、行为、食物摄入量），而体重仅在每隔一天采集鼻腔灌洗液样本时，在蝙蝠短暂吸入异氟烷麻醉下进行测量。处理和采样始终从未感染组开始，以尽量减少污染风险。

04. 接种途径和采样

在第一个实验中，每组 6 只蝙蝠分别通过口服、经口气管或鼻内途径接种 1×10⁴ TCID50（以下称为低剂量）的病毒，后两种途径在短暂异氟烷麻醉下进行，然后监测 14 天。三只未感染的动物在相同条件下饲养，并与感染动物一起采样。在感染前一天以及接种后第 1、3、5、7 和 11 天，用含有青霉素 / 链霉素（P/S）的 500 µL 最低必需培养基（MEM）收集口腔拭子样本。在接种后第 2、4、6、8 和 14 天，通过向两个鼻孔冲洗 200 µL PBS 收集鼻腔灌洗液样本。从接种前第 - 1 天到第 8 天以及第 11 天每天收集肛门拭子样本。样本在 - 80°C 下保存，直至进一步分析。在接种后第 4 天和第 14 天，每组三只动物通过深度异氟烷麻醉，然后心脏放血和颈椎脱臼进行安乐死。收集器官样本（鼻子、气管、肺、肺淋巴结、结肠、小肠、肠系膜淋巴结、大脑），并立即冷冻，用于进一步的 RT - qPCR 分析和病毒滴定。收集每只蝙蝠的血液，血清在 - 20°C 下保存，直至进行进一步分析（补充图 S7）。

在第二个实验中，每组 6 只埃及果蝠分别通过口服或鼻内途径接种 1×10⁶ TCID50（以下称为高剂量）的病毒。实验设置与第一轮相同，但这次在接种后第 2 天和第 6 天进行解剖（补充图 S7）。

图S7：实验流程示意图。感染 10⁴ TCID₅₀ （低剂量）和 10⁶ TCID₅₀ （高剂量）SARS-CoV-2 的埃及果蝠的实验流程示意图，包括样本采集方案和尸检时间点。

05. 生理参数的测定

0501. 核心体温和运动活动

在两项研究中，每组选取两只动物，使用腹腔植入的数据记录器 DST micro - ACT（Star-Oddi）测量核心体温和运动活动。在第二个实验中，每组额外一只动物植入测量核心体温的数据记录器 DST micro - ACT 和 DST nano - T（Star-Oddi）。DST micro - ACT 被编程为在整个研究期间，从 00:00 到 12:00 每 5 分钟记录一次温度和基于加速度的活动，从 12:00 到 00:00 每 10 分钟记录一次。数据记录器的安装、数据检索和解释均按照先前描述的方法进行。

0502. 每日能量消耗（DEE）

使用双标水（DLW）方法，对 29 只蝙蝠（第一次试验：三只未感染、四只口服感染、四只经口气管感染、四只鼻内感染；第二次试验：三只未感染、五只口服感染、六只鼻内感染）在感染后的最初 48 小时内，分别测定每日能量消耗。在 DEE 测量的第一天和最后一天，记录每只蝙蝠的精确体重。最初，通过穿刺翼膜静脉从每只分析的蝙蝠采集血液样本，以确定体液中 ²H 和 ¹⁸O 的背景同位素富集度。随后，每只蝙蝠按每千克体重腹腔注射 2.76±0.05 g 的双标水（65% ¹⁸O 和 35% ²H；纯度 99.90%）。然后，所有蝙蝠在 1 小时的平衡期内不接触食物或水，之后再采集一份血液样本，然后让动物再次接触食物和水。在注射双标水 48 小时后，采集最后一份血液样本，以确定同位素消除率。所有血液样本在 - 20°C 下保存，直至测定 ¹⁸O 和 ²H 水平。使用液体同位素水分析仪，对血液的同位素富集度进行盲法分析。每个同位素样本与五个实验室标准和国际标准一起运行，以将 δ 值校正为 ppm。根据建议，对于体重小于 5 kg 的动物，使用单池模型计算 CO₂产生率。

06. 病毒学和病理组织学分析

0601. RNA 提取和 qRT-PCR 定量 SARS-CoV-2 病毒 RNA

使用 “Viral RNA/DNA isolation NucleoMag®VET 试剂盒”，在 KingFisher Flex 纯化系统中，从口腔和肛门拭子样本、鼻腔灌洗液和组织样本中提取总 RNA。使用已发表的 qRT-PCR 方案检测 SARS-CoV-2 RNA。根据含有已知 SARS-CoV-2 拷贝数的 10⁻² 至 10⁻⁵稀释液确定的标准曲线，计算病毒基因组拷贝数。所有样本还分析了亚基因组 RNA（sgRNA）的存在情况，以作为病毒复制的指标。

0602. 组织病理学、免疫组织化学、RNA 原位杂交

对所有动物进行完整的尸检，从鼻甲、气管、食道、肺、脾、肝、心、肾、胃、小肠、大肠和大脑采集样本，固定在 10% 中性缓冲福尔马林溶液中。组织进行石蜡包埋，切成 2 - 3 µm 的切片，并用苏木精和伊红（HE）染色。为了检测 SARS-CoV-2 抗原，在连续切片上使用针对 SARS-CoV 核衣壳蛋白的单克隆抗体（克隆 4F3C4，稀释 1:50）。作为阴性对照，连续切片用无关抗体（甲型流感病毒的 M 蛋白，ATCC 克隆 HB - 64）标记。每次实验都包括一张来自感染 SARS-CoV-2 的叙利亚地鼠的阳性对照切片。

对选定的组织进行 RNA 原位杂交（RNA ISH），以验证 PCR 阳性结果（大脑样本 FH25 / 接种后第 2 天；肠道组织 FH35 / 接种后第 6 天）。按照制造商的说明，应用 RNAScope™2 - 5 HD Reagent Kit - Red（ACD）。对于 RNA - ISH，针对核衣壳蛋白定制设计 RNAScope™探针。作为技术检测对照，包括一个阳性对照探针（肽基脯氨酰异构酶 B）和一个阴性对照探针（二氢二吡啶酸还原酶）。所有切片使用 Hamamatsu S60 扫描仪进行扫描，并由一名经过认证的病理学家（AB，DiplECVP）使用 NDPview.2 plus 软件（版本 2.8.24，日本滨松市滨松光子学株式会社）进行盲法评估。

记录宏观病变，并对所有组织的 HE 染色切片进行评估和描述。在免疫组织化学（IHC）和 ISH 之后，根据有序量表对病毒抗原或 RNA 的分布进行分级，评分标准为：0 = 未检测到；1 = 局灶性，受影响细胞 / 组织＜5% 或每个组织最多 3 个病灶；2 = 多灶性，6 - 40% 受影响；3 = 融合性，41 - 80% 受影响；4 = 弥漫性，＞80% 受影响。根据形态学确定靶细胞。

07. 早期和晚期免疫反应分析：qRT-PCR 定量免疫基因表达以及细胞受体 ACE2 和蛋白酶 TMPRSS2 的表达

用 LunaScript RT SuperMix Kit 将 1 µg 纯化的 RNA 用于 cDNA 合成。qRT-PCR 反应使用 Luna® Universal qPCR Master Mix，按照制造商的说明进行设置：95°C 2 分钟；（95°C 30 秒，62°C 30 秒，72°C 1 分钟）共 40 个循环；72°C 10 分钟，然后在 4°C 无限期保持。除非另有说明，每个 qPCR 反应使用 100 ng cDNA。为了尽量减少移液误差，将模板稀释后，每个 qRT-PCR 反应使用 5 µL。使用 QuantStudioTM 6 Flex 实时 PCR 系统进行测量。所有后续计算采用重复四次反应的平均阈值循环（Ct），使用 ΔCt 方法。基因表达以真核翻译延伸因子 1α1（EEF1A1）进行归一化，并与相应的对照相比计算倍数变化。

研究人员还使用上述 PCR 方案，量化了三只模拟感染动物分析组织中 ACE2 和 TMPRSS2 的表达水平。本研究中使用的引物序列见表 1。

表1.用于量化免疫基因表达的引物序列。

08. 血清学分析

所有血清样本均使用基于微球的检测方法进行分析，所有结果均通过间接 ELISA 进行确认。

0801. 基于微球的检测方法

为此，使用 BioPlex 偶联试剂盒，按照制造商的说明，将 2019_nCoV Muc - IMB - 1 刺突蛋白的受体结合亚结构域 1（RBD - SD1）与磁性 COOH 微珠偶联。接下来，将每样本 50μL 微珠缓冲液中的 0.5μL 微珠加入到黑色 96 孔板的孔中。将板置于磁性板上 2 分钟，小心吸去微珠缓冲液。向孔中加入 50μL 在 PBS - T 中稀释 1:100 的血清样本，将板在室温下以 850 转 / 分钟的速度振荡孵育 1 小时。然后，将板置于磁性板上 2 分钟，用 PBS - T 洗涤 3 次，再次吸去洗涤缓冲液，之后向每孔加入 50μL 稀释 1:200 的小鼠抗人 IgG Fc 克隆 HP6017（该抗体对包括蝙蝠 IgG 在内的哺乳动物 IgG 具有广泛反应性），将板在室温下以 850 转 / 分钟的速度振荡孵育 1 小时。接着，再次用 PBS - T 洗涤板 3 次，然后向每孔加入 50μL 稀释 1:100 的 Alexa Fluor 532 山羊抗小鼠 IgG H + L广盛网，将板在室温下以 850 转 / 分钟的速度振荡孵育 1 小时。最后，将板置于磁性板上 2 分钟，用 PBS - T 洗涤 3 次，吸去洗涤缓冲液，向每孔加入 125μL 鞘液，将板在室温下以 850 转 / 分钟的速度振荡孵育 2 分钟。使用 Bio - Plex200 读数仪测量荧光。将分析样本的荧光强度（FI）值与研究人员的阳性对照（在早期研究中收集的血清学阳性埃及果蝠血清样本）的 FI 值相关联，并以 PP（阳性对照的百分比）表示。基于感染前收集的血清样本和模拟感染蝙蝠的血清样本（n = 42）的结果，该检测的临界值计算为 9.0 PP。

0802. 间接 SARS-CoV-2 RBD ELISA

使用已发表的方案并进行一些修改（包括使用稀释度为 1:30,000 的 Protein A/G）检测 SARS-CoV-2 特异性抗体。将分析样本的光密度（OD）值与研究人员的阳性对照（在早期研究中收集的血清学阳性埃及果蝠血清样本）的 OD 值相关联，并以 PP（阳性对照的百分比）表示。基于感染前收集的血清样本和模拟感染蝙蝠的血清样本（n = 42）的结果，该检测的临界值计算为 20.94 PP。

09. SARS-CoV-2 对 pH 和胃蛋白酶的敏感性

0901. 埃及果蝠胃肠道不同部位的 pH 测量

使用 pH 测量条（MQuant pH 指示剂条通用指示剂 - Supelco）擦拭 4 只未感染健康动物的胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠和直肠的胃肠道组织样本的上皮衬里，测量其 pH 值。

0902. SARS-CoV-2 蛋白在酸性条件下以及在胃和小肠样本匀浆中的稳定性

研究人员使用组织匀浆器，在匀浆缓冲液（cOmplete™蛋白酶抑制剂缓冲液）中制备埃及果蝠胃和小肠样本的 10%（w/v）组织匀浆。这种蛋白酶抑制剂缓冲液特异性抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶，但不影响金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。将 10⁸.⁶³ TCID₅₀的 SARS-CoV-2（100μL）与每个反应中的 150μL 1% 匀浆轻轻混合。然后，向相应的对照组中加入 3.5μL 1M HCl（最终 pH 为 2.5）或等体积的 H₂O。加入这些成分后，轻轻混合反应液，然后分别在 37°C 下孵育 1 分钟和 5 分钟。使用 1.5M Tris pH 8.8 将每个样本的 pH 值中和。

接下来，将 10⁸.⁶³ TCID₅₀的 SARS-CoV-2（100μL）与 150μL H₂O 混合，然后向该混合物中加入 3.5μL 1M HCl（最终 pH 为 2.5），相应的对照组用等体积的 H₂O 处理。加入 HCl 或 H₂O 后，轻轻混合反应体积，并在 37°C 下孵育，在 1 分钟和 5 分钟后分别收集样本。通过加入 1.5M Tris pH 8.8 中和样本的 pH 值。然后按照上述方法进行病毒滴定。

0903. SARS-CoV-2 蛋白对胃蛋白酶水解的敏感性

为了确认胃蛋白酶参与胃匀浆样本中的蛋白水解过程，并介导 SARS-CoV-2 的降解，研究人员在含有 1mM EDTA 的匀浆缓冲液（cOmplete™蛋白酶抑制剂缓冲液）中制备埃及果蝠胃样本的 10%（w/v）匀浆。将胃蛋白酶抑制剂 Pepstatin A（终浓度 40μM）加入到两份 200μL 组织匀浆中，向另外两份中加入等体积的未稀释 DMSO作为载体，轻轻混合，然后在 37°C 下孵育 10 分钟。

接下来，向每个反应中加入 125μL 10⁴.⁵ TCID₅₀/mL 的 SARS-CoV-2 并轻轻混合。向一份用 Pepstatin A 处理和一份用 DMSO 处理的样本中加入 1M HCl。向相应的对照组中加入等体积的 H₂O。将这些样本轻轻混合，并分别在 37°C 下孵育 1 分钟、5 分钟和 10 分钟。使用 1.5M Tris pH 8.8 中和样本的 pH 值。

0904. 用于定量 SARS-CoV-2 对胃蛋白酶敏感性的蛋白质免疫印迹分析

在稳定性研究的样本中加入 SDS-PAGE 上样缓冲液，在 95°C 下孵育 10 分钟，然后加载到 SDS-PAGE 凝胶上。将 SDS-PAGE 凝胶转移到 PVDF 转移膜上，用含有 0.05% 吐温 20（PBS - T）和 10%（w/v）脱脂奶粉的 PBS 封闭 4 小时。用于检测胃蛋白酶（（200 - 1176 - 0100），1:5000）、GAPDH（（MA5 - 15738），1:5000）、SARS-CoV-2 核衣壳（N）蛋白（BSV - N - 05，1:1000）和 SARS-CoV-2 刺突（S）蛋白（BSV - S2 - 01，1:1000）的一抗，加入到含有 5%（w/v）脱脂奶粉的 PBS - T 中，在室温下孵育过夜。用 PBS - T 洗涤膜，然后在含有 5%（w/v）脱脂奶粉的 PBS - T 中孵育二抗，山羊抗小鼠 HRP（1:2,000）和驴抗山羊 HRP（1:10,000），孵育 1 小时。使用 ECL（Clarity Western ECL 底物（170 - 5061））通过化学发光法显影蛋白质免疫印迹。

将 SDS-PAGE 凝胶用 Protein Ark 快速考马斯亮蓝染色液染色 2 小时，然后用蒸馏水洗涤以脱色并去除背景染色。使用 ImageJ 1.54g（ImageJ 软件）通过半定量密度测定法分析考马斯亮蓝染色的 SDS-PAGE 凝胶和免疫印迹。

10. 统计分析

使用未配对 t 检验和方差分析（ANOVA）以及 Tukey 事后检验对实验组的均值进行比较，以进行多重比较。在进行这些检验之前，评估数据分布和正态性，以确保进行适当的统计分析。使用 Shapiro - Wilk 检验评估数据的正态性，使用 Levene 检验检查方差的齐性。鉴于数据满足正态性假设，选择参数检验。使用 SPSS 软件（版本 20.）进行数据分析，显著性水平设定为 p 值＜0.05。

使用 RStudio 版本 1.4.1103 中的 aov（ANOVA）函数分析双标水研究的数据。研究人员还将蝙蝠的体重与每日能量消耗之间的关系，与已发表的通过双标水方法测量的蝙蝠物种的每日能量消耗值进行比较（见补充材料）。为此，研究人员使用系统发育广义最小二乘法（PGLS）评估研究结果与已发表的蝙蝠物种每日能量消耗和体重数据的关系，以考虑由于物种共享进化历史可能导致的数据不独立性。统计程序在其他地方有详细描述。系统发育树来自已发表的哺乳动物超树，该超树包括 4510 个物种，并根据分歧时间的年代估计更新了分支长度。使用 RStudio 中的 “系统发育和进化分析” 软件包和 “进化多样化分析” 软件包，对哺乳动物超树进行修剪，使其仅包含相关物种，即蝙蝠（n = 11）。使用 RStudio 中的 “系统发育和进化比较分析” 软件包，对对数转换后的性状数据实施 PGLS 方法，并使用最大似然法确定 Pagel 分支长度转换（lambda，λ）。

11. 一只动物的排除

一只经高剂量口服攻毒的动物（ID FH 35）的结果与鼻内攻毒的蝙蝠完全匹配。因此，研究人员不能排除该动物意外经鼻内接种了部分接种物的可能性，所以该动物被完全排除在分析之外。

三、结果

01. SARS-CoV-2 细胞受体 ACE2 以及蛋白酶 TMPRSS2 在分析组织中的表达

为了了解 SARS-CoV-2 在不同组织中建立感染的能力，研究人员通过 qPCR 评估了对 SARS-CoV-2 细胞进入至关重要的 ACE2 和 TMPRSS2 的基因表达水平。除了气管外，来自呼吸道和消化道的分析组织均表现出较高的 ACE2 表达水平，而在大脑和脾脏中的表达较低。令人惊讶的是，肺淋巴结在所有测试组织中显示出最高的 ACE2 表达。这些组织中 TMPRSS2 的表达也很容易检测到，尽管水平较低（图 1）。总体而言，ACE2 和 TMPRSS2 均在埃及果蝠的呼吸道和消化道中表达。

图1. ACE2 和 TMPRSS2 在埃及果蝠不同组织中的相对表达。ACE2 和 TMPRSS2 的表达水平以管家基因 EEF1A1 的表达进行归一化。热图显示了 3 只未感染动物的相对表达水平的平均值。颜色刻度表示从较低（绿色）到较高（红色）的相对基因表达水平。

02. SARS-CoV-2 攻毒对生理参数的影响极小

研究人员在任何一只攻毒动物中均未观察到持续的疾病临床症状，如身体姿势改变或食物摄入量减少。

在尸检过程中，研究人员发现两只未感染的蝙蝠、两只鼻内感染的蝙蝠以及一只经口气管和一只口服低剂量攻毒的蝙蝠处于早期妊娠阶段。在高剂量研究中，一只口服攻毒的蝙蝠在尸检时被确定为怀孕。

0201. SARS-CoV-2 攻毒后体重无感染相关变化

在使用低剂量的第一项研究中，口服和经口气管攻毒的蝙蝠在接种后 2 天内体重有所下降，而鼻内感染的蝙蝠在此期间体重保持不变。从接种后 4 天到实验结束，所有动物的平均体温和运动活动水平在白天略高于未感染的蝙蝠（图 2B、D，补充表 S1）。虽然鼻内攻毒的蝙蝠的值与未感染对照组接近，但在此期间经口气管和口服攻毒的蝙蝠的值明显更高（补充表 S1）。然而，这些不同的平均体温和运动活动值在接种前第 - 1 天测量开始时就已经可以观察到（图 2A、C）。有趣的是，经口气管甚至口服攻毒的蝙蝠体温变化范围更大，分别在 33.5°C 至 40.6°C 和 32.6°C 至 40.7°C 之间，而鼻内攻毒的蝙蝠体温值在 35.4°C 至 40.3°C 之间（图 2B）。在夜间，所有攻毒蝙蝠的运动活动均低于未感染对照组，其中经口气管和口服攻毒的蝙蝠活动水平最低（图 2D，补充表 S1）。相反，在白天，经口气管和口服攻毒的蝙蝠比未感染对照组表现出更高的活动水平（图 2D，补充表 S1）。

表S1.两项研究中不同感染组测量的平均（白天与夜间）体温和运动活动。注：n.d.= 未进行；灰色 = 夜间；白色 = 白天。

在使用高剂量的第二项研究中，所有动物在 6 天内体重稳步增加（补充图 S1B）。怀孕动物的体重变化与本研究中的其他动物没有差异。

图2. 接种 SARS-CoV-2 后不同时间点的核心体温和运动活动。数据描绘了未感染（蓝色；n = 1）、鼻内感染（红色；n = 2）、经口气管感染（紫色；n = 2）和口服感染（绿色；n = 2）的蝙蝠，比较核心体温（°C）和运动活动（以平均外部加速度，AvgEA，毫 g 为单位测量）。黑色线条标记感染时间点为接种后第 0 天。白色表示白天，灰色表示夜间，x 轴上的刻度（A、C）表示午夜。（A）显示平均核心体温，（C）显示平均 AvgEA，均为从接种前第 - 1 天到第 10 天的 10 分钟平均值。（B）说明了（A）中体温测量值的分布，（D）显示了（C）中的 AvgEA，均围绕平均值（黑色虚线水平线）绘制，并带有标准差（误差条）。

图S1：埃及果蝠经不同接种途径（鼻内、口气管和口服）感染 SARS-CoV-2 后的体重变化。每组 6 只蝙蝠，分别经鼻内、口气管或口服途径接种低剂量（10⁴ TCID₅₀）的 SARS-CoV-2，并监测 14 天（A）；或经鼻内或口服途径接种高剂量（10^(6) TCID₅₀)的 SARS-CoV-2，并监测 6 天（B）。每项研究中均设 3 只动物作为未感染对照动物。图表显示相对于接种后 0 天的体重变化百分比，条形表示平均值和标准差。

0202. SARS-CoV-2 攻毒后运动活动和核心体温的微小变化

研究人员主要观察到夜间昼夜节律，在两项实验中，体温和活动水平在夜间最高（图 2 和图 3，补充表 S1）。在白天应用双标水、病毒攻毒和定期采样过程中对动物的处理，导致体温升高，同时运动活动水平较低（图 2C 和图 3C）。然而，由于每组动物数量较少，研究人员无法对这些生理数据进行统计分析。

在低剂量攻毒实验中，未感染的对照组保持明显同步的夜间昼夜节律，而攻毒动物在感染后的前三天部分失去了这种节律（图 2A）。所有攻毒蝙蝠在白天的平均体温和运动活动水平略高于未感染的蝙蝠（图 2B、D，补充表 S1）。虽然鼻内攻毒的蝙蝠的值与未感染对照组接近，但在此期间经口气管和口服攻毒的蝙蝠的值明显更高（补充表 S1）。然而，这些不同的平均体温和运动活动值在接种前第 - 1 天测量开始时就已经可以观察到（图 2A、C）。有趣的是，经口气管甚至口服攻毒的蝙蝠体温变化范围更大，分别在 33.5°C 至 40.6°C 和 32.6°C 至 40.7°C 之间，而鼻内攻毒的蝙蝠体温值在 35.4°C 至 40.3°C 之间（图 2B）。在夜间，所有攻毒蝙蝠的运动活动均低于未感染对照组，其中经口气管和口服攻毒的蝙蝠活动水平最低（图 2D，补充表 S1）。相反，在白天，经口气管和口服攻毒的蝙蝠比未感染对照组表现出更高的活动水平（图 2D，补充表 S1）。

在高剂量攻毒实验中，所有动物继续保持同步的夜间昼夜节律。所有组的体温曲线相似，白天平均体温较低，夜间较高（图 3A）。此外，所有组的平均体温曲线也相似（图 3B广盛网，补充表 S1）。口服攻毒组在白天的运动活动水平略高，而在夜间，所有攻毒蝙蝠的运动活动水平略低于未感染对照组（图 3D，补充表 S1）。如前所述，口服攻毒的蝙蝠在接种后第 2 天至第 4 天的夜间运动活动较低（图 3C），而在此期间体温较高（图 3A）。鼻内攻毒的蝙蝠平均运动活动较低，而口服攻毒的蝙蝠与未感染蝙蝠的运动活动曲线相似（图 3D）。由于每组携带这些数据记录器的动物数量较少，无法对获得的数据进行统计分析。

图3. 接种 10⁶ TCID₅₀ SARS-CoV-2 后不同时间点的核心体温和运动活动。数据描绘了未感染（蓝色）、鼻内感染（红色）和口服感染（绿色）的蝙蝠，比较核心体温（°C）和运动活动（以平均外部加速度，AvgEA，毫 g 为单位测量）。黑色线条标记感染时间点为接种后第 0 天。白色表示白天，灰色表示夜间，x 轴上的刻度（A、C）表示午夜。（A）显示平均核心体温，（C）显示 AvgEA，均为从接种前第 - 1 天到第 6 天的 10 分钟平均值。（B）说明了（A）中体温测量值的分布，（D）显示了（C）中的 AvgEA，均围绕平均值（黑色虚线水平线）绘制。平均核心体温基于每种条件下至少两只植入记录器的蝙蝠（n = 2）。

在高剂量攻毒实验中，所有动物继续保持同步的夜间昼夜节律。所有组的体温曲线相似，白天平均体温较低，夜间较高（图 3A）。此外，所有组的平均体温曲线也相似（图 3B，补充表 S1）。口服攻毒组在白天的运动活动水平略高，而在夜间，所有攻毒蝙蝠的运动活动水平略低于未感染对照组（图 3D，补充表 S1）。如前所述，口服攻毒的蝙蝠在接种后第 2 天至第 4 天的夜间运动活动较低（图 3C），而在此期间体温较高（图 3A）。鼻内攻毒的蝙蝠平均运动活动较低，而口服攻毒的蝙蝠与未感染蝙蝠的运动活动曲线相似（图 3D）。由于每组携带这些数据记录器的动物数量较少，无法对获得的数据进行统计分析。

0203. 攻毒蝙蝠的每日能量消耗未改变

研究人员观察到，使用两种 SARS-CoV-2 感染剂量，不同接种途径感染的动物在累积每日能量消耗（DEE）（F₃,₂₅ = 0.05；p = 0.985）和总水摄入量（TWI）（F₃,₂₅ = 0.28；p = 0.837）方面没有差异（补充图 S2A；F₃,₂₆ = 0.03，p = 0.98）。所有蝙蝠（两个剂量组）的 DEE 平均值为：未感染蝙蝠 214±7 kJ/d，口服、鼻内和经口气管感染 SARS-CoV-2 的蝙蝠分别为 206±17 kJ/d、208±3 kJ/d 和 213±38 kJ/d。所有 DEE 测量的平均值为 209±8 kJ/d。与 DEE 相似，TWI 也不受感染途径的影响（补充图 S2B；F₃,₂₅ = 0.28；p = 0.837）。未感染蝙蝠的总水摄入量平均为 105±4 mL/d，口服、鼻内和经口气管感染 SARS-CoV-2 的蝙蝠分别为 110±13 mL/d、101±5 mL/d 和 112±22 mL/d。所有 TWI 测量的平均值为 105±5 mL/d（补充图 S2B）。已发表的 11 种蝙蝠物种的 DEE 值，体重范围从 7.3 g（普通伏翼蝠，Pipistrellus pipistrellus）到 80.8 g（长舌叶口蝠，Phyllostomus hastatus），可用于与埃及果蝠（98 - 128 g）的研究结果进行系统发育相关性分析。得到的回归方程为 DEE（kJ d⁻¹） = 5.79× 体重⁰.⁷⁵ + 0.12，估计的最大似然 λ 为 0（补充表 S2 和 S3），即该方程遵循普通最小二乘回归。

图S2：未感染或经口服、鼻内或口气管接种 SARS-CoV-2 的埃及果蝠的日能量消耗（A）和总水周转率（B），通过双标水法在两天内进行测量。

表S2.12 种蝙蝠的每日能量消耗和体重。注：使用双标水法测量每日能量消耗的 12 种蝙蝠的系统发育树，采用 Newick 格式：((埃及果蝠：24.6, 澳大利亚长舌果蝠：24.6):46.6,(双色囊喉蝠：69.2,((加州叶鼻蝠：27.3, 长舌叶口蝠：27.3):0.5,((科氏长舌蝠：19.4, 缨唇蝠：19.4):7.3, 短尾叶口蝠：26.7):1.1):32.2,(((普通伏翼蝠：26, 大棕蝠：26):0, 须鼠耳蝠：26):0, 棕蝠：26):34):9.2):2)

图S3：蝙蝠的日能量消耗。使用双标水法测量的蝙蝠能量消耗（EE）与体重之间的关系。每个灰色数据点代表一种不同的蝙蝠物种（n=11，见补充表 S2），红色数据点是本研究中未感染的埃及果蝠的结果。

03. SARS-CoV-2 攻毒后的病毒排出和组织分布

0301. 口服感染后的病毒排出低于鼻内或经口气管攻毒

首先，研究人员分析了埃及果蝠对通过三种不同感染途径（鼻内、经口气管和口服）接种 10⁴ TCID₅₀ SARS-CoV-2 的易感性。研究人员能够在鼻内和经口气管接种的蝙蝠的口腔和肛门拭子样本中，检测到稳定水平的病毒基因组 RNA（gRNA）和亚基因组 RNA（sgRNA），直至接种后 7 天，之后逐渐下降，直至接种后 11 天（图 4A、B）。相比之下，研究人员仅在一只口服接种的蝙蝠的口腔拭子中（接种后第 5 天）和肛门拭子中（接种后第 7 天）检测到痕量的 gRNA，这两个样本的 gRNA 水平与其他组相比均有显著差异（补充表 S3）。在鼻内和经口气管接种的蝙蝠样本中可检测到的 sgRNA 几乎与 gRNA 水平相同，表明在采样的上皮细胞中有强劲的病毒复制。然而，在口服接种的蝙蝠的拭子中根本检测不到 sgRNA（图 4A、B）。在接种后第 1 天，经口气管感染的果蝠口腔排出的病毒 RNA 水平高于鼻内感染的动物；但在接种后第 3 天，情况相反，鼻内攻毒动物的口腔拭子显示出明显更高水平的 gRNA 和 sgRNA（图 4A）。在接下来的几天里，两组的病毒 RNA 水平相当（图 3A），除了在接种后第 3 天从一只鼻内接种的蝙蝠采集的一个阳性口腔拭子（10¹.⁷⁵ TCID₅₀/mL）外，未检测到具有复制能力的病毒（图 4A）。粪便中病毒 RNA（包括 gRNA 和 sgRNA）的排出与报道的口腔排出模式相同。同样，尽管病毒 RNA 水平较高，但除了在接种后第 5 天从一只经口气管接种的蝙蝠采集的一个样本（10².⁷⁵ TCID₅₀/mL）外，未检测到具有复制能力的病毒（图 4B）。

表S3.RT-qPCR 数据的统计分析。注：无显著差异：NS，显著差异：p 值 < 0.05*。

在研究人员的实验设置中，鼻腔灌洗液样本通常比拭子样本产生更高水平的病毒 RNA 和具有复制能力的病毒。因此，通过鼻内和经口气管途径接种的动物排出的病毒 gRNA 水平高达每微升样本 10⁷个基因组拷贝，而口腔拭子样本中最高为 10³ 个基因组拷贝，且 sgRNA 水平略低（图 4C）。这次，研究人员在口服接种的动物中也检测到了病毒 gRNA，但未检测到 sgRNA，尽管其水平明显低于鼻内和经口气管接种的蝙蝠（图 4C，补充表 S3）。此外，虽然在鼻内和经口气管接种的蝙蝠中能够检测到具有复制能力的病毒，在接种后第 2 天和第 4 天达到高达 10⁴.⁵ TCID₅₀/mL 的水平，但在口服接种的蝙蝠的任何鼻腔灌洗液样本中均未检测到具有复制能力的病毒（图 4C）。

图4. 接种 10⁴ TCID₅₀ SARS-CoV-2（低剂量）后不同途径接种的病毒排出情况。通过不同途径攻毒后，在口腔拭子（A）、肛门拭子（B）和鼻腔灌洗液样本（C）中检测到的病毒 RNA 的 gRNA 和 sgRNA 拷贝数（Log₁₀），以及具有复制能力的病毒（Log₁₀ (TCID₅₀/mL)）（红色）。注意：代表未感染的圆圈在这个对数刻度上不显示，因为这些值为零。

在第二个实验中，研究人员比较了在感染早期（直至接种后 6 天）鼻内和口服接种更高感染剂量后的病毒排出模式（图 5）。在鼻内接种的蝙蝠的口腔（图 5A）和肛门（图 5B）拭子样本中，检测到的病毒 gRNA 和 sgRNA 水平与第一项研究中的相似。然而，虽然在口服接种的蝙蝠的口腔拭子样本中未检测到病毒 RNA（gRNA 和 sgRNA），但在口服接种的蝙蝠的肛门拭子中，在接种后第 2 天和第 5 天检测到 gRNA 排出，尽管水平明显较低（图 5B，补充表 S3）。在鼻内感染的蝙蝠的口腔（10¹.⁷⁵至 10² TCID₅₀/mL）和肛门（10¹.⁷⁵ TCID₅₀/mL）拭子中，在接种后第 1 天和第 2 天可检测到低水平的具有复制能力的病毒，而在口服攻毒的蝙蝠中未检测到复制的病毒（图 5A、B）。

图5. 接种 10⁶ TCID₅₀ SARS-CoV-2（高剂量）后不同途径接种的病毒排出情况。通过不同途径攻毒后，在口腔拭子（A）、肛门拭子（B）和鼻腔灌洗液样本（C）中检测到的病毒 RNA 的 gRNA 和 sgRNA 拷贝数（Log₁₀），以及具有复制能力的病毒（Log₁₀ (TCID₅₀/mL)）（红色）。注意：代表未感染的圆圈在这个对数刻度上不显示，因为这些值为零。

在更高感染剂量攻毒后，在口服接种的蝙蝠的鼻腔灌洗液样本中，在接种后第 2 天和第 4 天也检测到病毒 gRNA，尽管与鼻内接种的蝙蝠相比水平明显较低（补充表 S3）。在接种后第 4 天，在一只口服接种的蝙蝠中检测到痕量的 sgRNA，同样与鼻内接种的蝙蝠相比水平明显较低，在鼻内接种的蝙蝠中，在接种后第 2 天和第 4 天检测到 sgRNA。仅在鼻内接种的蝙蝠的鼻腔灌洗液样本中检测到高达 10⁴.²⁵ TCID₅₀/mL 的具有复制能力的病毒（图 5C，补充表 S3）。

0302. 口服攻毒后组织受累明显减少

在低剂量感染后，研究人员在接种后第 4 天，在至少一只鼻内感染动物的鼻甲中检测到高达 10⁶拷贝 /µL RNA 的病毒 gRNA，在呼吸道和消化道的所有其他分析组织以及大脑和脾脏中检测到低于 10³ 拷贝 /µL RNA 的病毒 gRNA（图 6A）。在 3 只鼻内接种的蝙蝠中，有 2 只的鼻甲样本中存在具有复制能力的病毒，滴度高达 10⁵ TCID₅₀/mL（图 6A）。免疫组化证实，在 3 只鼻内感染蝙蝠的 2 只鼻甲样本的呼吸道纤毛上皮中存在病毒抗原（图 7），而使用这种方法在所有其他组织中均为阴性。在经口气管接种的蝙蝠中，除小肠、大脑和脾脏外，在所有器官样本中均可检测到 gRNA（图 6A），但通过免疫组化在这些动物中未检测到病毒抗原。在接种后第 14 天，在鼻内感染蝙蝠的鼻甲（2/3）中仍可检测到病毒 gRNA，而在经口气管接种的蝙蝠中，gRNA 存在于鼻甲中。有趣的是，研究人员还在低剂量攻毒后经口气管感染的蝙蝠的大脑（1/3，ID FH 15）和脾脏（ID FH 14）中检测到病毒 gRNA 和 sgRNA（图 6B）。在接种后第 14 天，在任何样本中均未检测到具有复制能力的病毒（图 6B），并且通过免疫组化在任何组织中均为阴性。同时，在口服攻毒的蝙蝠中，仅在肺（1/3，ID FH 18）和大脑（1/3；ID FH 16）中检测到痕量的 gRNA，与鼻内接种的蝙蝠样本相比水平明显较低（补充表 S3）。除此之外，在接种后第 4 天或第 14 天，通过 PCR、组织病理学和免疫组化，研究人员在口服感染动物的任何组织中均未发现病毒复制的迹象。此外，在接种后第 4 天或第 14 天，研究人员在血清样本中未检测到病毒 RNA（图 6A、B）。

图6. SARS-CoV-2 RNA 在组织和血清样本中的 gRNA 和 sgRNA 拷贝数（Log₁₀）。接种 10⁴ TCID₅₀在接种后第 4 天（A）和第 14 天（B），以及接种 10⁶ TCID₅₀在接种后第 2 天（C）和第 6 天（D），以及具有复制能力的病毒（Log₁₀ (TCID₅₀/mL)）（红色）。注意：代表未感染的圆圈在这个对数刻度上不显示，因为这些值为零。

图7. 接种后第 2 天和第 4 天鼻甲中 SARS-CoV-2 病毒抗原的检测。鼻呼吸上皮在鼻内感染后 2 天和 4 天对冠状病毒核衣壳抗原呈免疫阳性（绿色箭头）。注意接种后第 4 天管腔内的细胞碎片（黑色箭头）和黏膜水肿（黑色星号），表明存在急性坏死性鼻炎（A）。主要靶细胞是纤毛（黑色箭头）呼吸上皮，此处显示为接种后第 2 天（B）。免疫组化，抗生物素蛋白 - 生物素复合物法，氨基乙基咔唑色原（红棕色）， Mayer 苏木精复染（蓝色）。标尺 50 µm（A）或 25 µm（B）。

高剂量接种导致鼻内感染动物在接种后第 2 天出现类似的分布模式（图 6C），其 gRNA 和 sgRNA 水平高于第一项研究中接种后第 4 天的水平（图 6A），这也通过免疫组化得到证实（图 7）。此外，使用该剂量，研究人员在一只口服接种的蝙蝠（1/3；ID FH 31）的鼻甲中检测到 gRNA 和 sgRNA，该蝙蝠在接种后第 2 天被处死，其水平与鼻内接种的蝙蝠样本相比明显较低（补充表 S3）。研究人员还在该动物的气管、肺淋巴结、大脑和肠系膜淋巴结中检测到 gRNA（但未检测到 sgRNA），其水平与鼻内接种的蝙蝠样本相比明显较低（补充表 S3）。研究人员还在另一只口服攻毒的蝙蝠（ID FH 33）的结肠样本中检测到 gRNA，其水平与鼻内接种的蝙蝠样本相当（图 6C）。虽然在鼻内接种的蝙蝠的鼻甲样本（10³.⁷⁵至 10⁷ TCID₅₀/mL）中可检测到具有复制能力的病毒（3/3），但在任何口服接种的蝙蝠样本中均未检测到具有复制能力的病毒（图 6C）。

值得注意的是，研究人员在一只高剂量鼻内攻毒的蝙蝠（ID FH 25）的大脑中检测到高水平的 gRNA 和 sgRNA，以及 10³ TCID₅₀的具有复制能力的病毒。由于该结果无法通过免疫组化确认，研究人员进行了原位杂交（ISH）分析，证实了该动物小脑（神经元、脑膜细胞、脑室衬里细胞）中存在病毒 RNA（图 8）。有趣的是，在该动物的嗅叶中未检测到病毒 RNA，这表明在这种情况下嗅神经不太可能是病毒的进入途径。该动物的所有其他分析组织通过 ISH 均为阴性（补充表 S4）。然而，在该动物中，除了肺和脾脏外，在所有分析样本中均检测到 sgRNA。该动物未怀孕，且未观察到生理异常。在后续对 PCR 阳性结果进行 ISH 分析的其他样本中，均未通过 ISH 检测呈阳性。然而，在感染高剂量病毒的动物的肠腔中，无论接种途径如何，均发现了色原沉淀（补充表 S4）。

图8. 鼻内接种 10⁶ TCID₅₀ SARS-CoV-2 后第 2 天，动物 ID FH25 小脑脑样本的原位杂交。使用针对核衣壳蛋白的探针，显示靶细胞（包括小脑神经元（A）和脑膜（B）细胞）的显色标记，但阴性对照（C）探针（二氢二吡啶酸还原酶）未显示标记。RNAscope© 原位杂交，显色标记（快红），Mayer 苏木精复染（蓝色）。标尺 50 µm。

表S4.原位杂交（ISH）结果。注：FH 35：由于在该动物中观察到意外的病毒分布模式，表明可能发生了意外的鼻内感染，因此该动物被排除在整体分析之外。

在接种后第 6 天，在所有鼻内接种的蝙蝠（3/3）的鼻甲中均可检测到病毒 gRNA 和 sgRNA。在结肠（1/3；ID FH 29）、小肠（3/3）、肺和肠系膜淋巴结（均为 2/3）以及脾脏（1/3；ID FH 30）样本中可检测到 gRNA。在一只口服接种的蝙蝠（1/3；ID FH 34）的结肠样本中可检测到病毒 gRNA，但未检测到 sgRNA，与第一项实验相同，与鼻内接种的蝙蝠的 gRNA 水平相比无统计学显著差异（图 6D，补充表 S3）。在接种后第 6 天，从这些器官样本中均未分离出具有复制能力的病毒（图 6D），但免疫组化显示其中一只动物的鼻呼吸上皮中有一个阳性细胞（由于退行性变化，细胞未具体说明）。研究人员在接种后第 2 天在一只鼻内接种的蝙蝠（1/3；ID FH 27）的血清样本中检测到 gRNA，但未检测到 sgRNA（图 6C），在接种后第 6 天在两只鼻内接种的蝙蝠（2/3；ID FH 28 和 29）的血清样本中检测到 gRNA（图 6D）。口服接种的蝙蝠在接种后第 2 天的血清样本中病毒 RNA 检测为阴性（图 6C）。然而，研究人员在接种后第 6 天在一只口服接种的蝙蝠（1/2；ID FH 36）的血清样本中检测到低水平的 gRNA（图6D）。

在两项研究中，怀孕和未怀孕动物之间在病毒排出模式或器官受累方面均未观察到明显差异。

04. 微弱的干扰素和抗体反应

0401. 不同感染途径 SARS-CoV-2 攻毒后的免疫基因表达

为了进一步阐明与感染途径相关的病毒排出和病毒分布差异背后的机制，研究人员研究了 I 型、II 型和 III 型干扰素的表达水平。尽管在鼻内和经口气管感染后，大多数器官中都检测到了 SARS-CoV-2 RNA，但与未感染对照组相比，I 型、II 型和 III 型干扰素的表达并未升高，只有在经口气管接种 SARS-CoV-2 后，支气管淋巴结中的 IFNβ1 有明显诱导（图 9A）。一致地，经口气管感染后，支气管淋巴结中干扰素诱导的趋化因子 CXCL10 的表达也显著上调（图 9B）。有趣的是，经口气管感染还在接种后第 4 天诱导了气管中 IFNγ 的表达（图 9C）。相比之下，没有任何一种感染途径能引起 III 型干扰素 IFNλ3 的表达（图 9D）。

图9. 鼻内、经口气管或口服攻毒的埃及果蝠的免疫基因表达。每组三只埃及果蝠分别经鼻内（红色）、经口气管（绿色）或口服（蓝色）接种低剂量 SARS-CoV-2（10⁴ TCID₅₀），而对照动物用细胞培养基进行模拟感染（黑色）。在接种后第 4 天，通过 qPCR 分析 IFNβ1（A）、CXCL10（B）、IFNγ（C）和 IFNλ3（D）的表达。数据以平均值 ± 标准误表示；p 值使用双向方差分析和 Tukey 多重比较检验计算。（*）p<0.05，（**）p<0.01，（***）p<0.001，（****）p<0.0001。

在使用高剂量的第二项试验中，研究人员仅在口服感染蝙蝠的结肠中检测到 IFNβ1 表达在接种后第 2 天被诱导（补充图 S4A）。尽管鼻内感染后鼻子中的 IFNβ1 表达没有增加，但在接种后第 6 天，鼻内感染后 CXCL10 的表达显著升高（补充图 S4D）。对于任何一种感染途径，均未观察到 II 型或 III 型干扰素的统计学显著诱导。

图S4：经高剂量（10⁶ TCID₅₀ ）SARS-CoV-2 鼻内或口服攻击的埃及果蝠的免疫基因表达。每组 3 只埃及果蝠经鼻内接种高剂量（10⁶ TCID₅₀ ）的 SARS-CoV-2，并在接种后 2 天（红色）或 6 天（橙色）处死；或经口服相同剂量并在接种后 2 天（绿色）或 6 天（蓝色）处死，而对照动物用细胞培养基进行假感染（黑色）。分析了 IFNβ1（A）、CXCL10（B）、IFNγ（C）和 IFNλ3（D）的表达。数据以平均值 ± 标准误表示；p 值通过双向方差分析和 Tukey 多重比较检验计算。（）p < 0.05，（）p < 0.01，（）p < 0.001，（****）p < 0.0001。

0402. 仅在鼻内和经口气管攻毒的蝙蝠中可检测到针对 SARS-CoV-2 的血清抗体

首先，研究人员进行了基于微球的检测，以评估抗 SARS-CoV-2 特异性 IgG 抗体的水平。正如预期的那样，直到接种后第 6 天均未观察到血清转化，而在接种后第 14 天，三只鼻内接种的蝙蝠和三只经口气管接种的蝙蝠中有两只发生了血清转化（补充图 S5）。在任何时间点，口服攻毒的蝙蝠均未显示出血清转化。接下来，所有血清均使用间接 ELISA 重新检测，结果显示两种方法之间具有高度一致性（补充图 S5）。

图S5：在接种后 2、4、6 和 14 天采集的蝙蝠血清的基于微球的 SARS-CoV-2 检测（红色）和 ELISA 检测（黑色）。阳性百分比值（%）与阳性对照（PP）进行比较。（接种后 2 天：未感染 n = 3，鼻内接种 n = 6；口服接种 n = 6；接种后 4 天：未感染 n = 3，鼻内接种 n = 6，经口气管接种 n = 3，口服接种 n = 6；接种后 6 天：未感染 n = 3，鼻内接种 n = 3，口服接种 n = 3；接种后 14 天：未感染 n = 3，鼻内接种 n = 3，经口气管接种 n = 3，口服接种 n = 3）。鼻内和经口气管接种的蝙蝠在接种后 14 天出现血清转化，而口服接种的蝙蝠未检测到血清学反应。

05. SARS-CoV-2 病毒粒子在口服后不稳定

0501. 埃及果蝠胃肠道各部分的 pH 值变化

首先，研究人员测量了埃及果蝠胃肠道上皮衬里的 pH 值。测量结果表明，胃呈酸性，pH 值约为 3（±0.5），而其余所有检测的上皮衬里均呈弱酸性，pH 值约为 6（补充图 S6）。

图S6：埃及果蝠胃肠道不同部位的 pH 值。对胃肠道不同部位的上皮进行检测，并用 pH 测量条擦拭暴露的上皮进行 pH 测量（n = 4）。胃部的 pH 值呈酸性，平均值为 3，而所有肠道样本的 pH 值接近中性，为 6。

0502. SARS-CoV-2 对埃及果蝠胃中的胃蛋白酶消化敏感

为了探究口服攻毒在很大程度上无法有效建立 SARS-CoV-2 感染的原因，研究人员评估了 SARS-CoV-2 病毒粒子在埃及果蝠胃肠道中的稳定性，胃是病毒口服后需要克服的第一个重要障碍。为了模拟胃中胃蛋白酶原 / 胃蛋白酶的释放和活性，研究人员将胃匀浆与 SARS-CoV-2 一起孵育，并以小肠匀浆作为对照。根据测量的胃肠道上皮衬里的 pH 值，研究人员用 H₂O 或 HCl（最终 pH 约为 2.5）孵育样本以激活胃蛋白酶原。只有用 HCl 激活的胃匀浆，而不是用 H₂O 激活的，显示出蛋白质条带强度明显下降（图 10A），在激活后 1 分钟和 5 分钟分别显著下降约 69%（±9%）和 77%（±6%），而在小肠匀浆中未观察到这种情况（图 10B）。

图10. 用 HCl 激活的埃及果蝠胃匀浆可有效消化 SARS-CoV-2 的 S 和 N 蛋白。考马斯亮蓝染色的 SDS-PAGE 凝胶（A）和（B）中各泳道的密度分析，以相应的 H₂O 处理样本进行归一化。SARS-CoV-2 刺突蛋白和核衣壳蛋白、胃蛋白酶和 GAPDH 的 SDS-PAGE 凝胶的代表性蛋白质免疫印迹（C）。蛋白质免疫印迹的密度分析，以相应的 H₂O 处理样本进行归一化（D-F）。HCl 降低了 SARS-CoV-2 的感染性（G）。误差条表示三个独立实验的标准差（n = 3）；p 值使用双向方差分析和 Tukey HSD 事后检验计算。无显著性差异（ns），（****）p<0.0001。

研究人员推测，胃匀浆中存在胃蛋白酶原，其经酸激活形成的胃蛋白酶介导了蛋白水解。对这些裂解物的蛋白质免疫印迹分析证实，胃蛋白酶原仅存在于胃匀浆中，而不存在于小肠匀浆中。此外，仅在 HCl 处理的组分中观察到胃蛋白酶原向胃蛋白酶的转化（图 10C）。蛋白质免疫印迹分析显示，在含有激活胃蛋白酶的样本中，病毒 S 蛋白水平在激活后 1 分钟和 5 分钟分别显著下降约 85%（±9%）和 91%（±8%），N 蛋白水平分别显著下降约 85%（±4%）和 84%（±12%），GAPDH 水平在激活后 1 分钟和 5 分钟分别显著下降约 99.9%（±0.1%）（图 10D-F）。此外，这种减少仅在胃匀浆中观察到，而在小肠匀浆中未观察到。

0503. SARS-CoV-2 对胃蛋白酶消化的敏感性

接下来，研究人员想要证实埃及果蝠的胃蛋白酶参与了蛋白水解过程，并介导了 SARS-CoV-2 的降解。因此，研究人员将胃蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶抑制剂 Pepstatin A 或载体 DMSO 添加到含有不抑制天冬氨酸蛋白酶活性的蛋白酶抑制剂的埃及果蝠胃匀浆中。当将 SARS-CoV-2 添加到随后用 H₂O 或 HCl 激活的组分中时，用 DMSO 处理并经 HCl 激活的泳道显示出蛋白质条带强度明显下降，在激活后 1 分钟、5 分钟和 10 分钟分别显著下降约 68%（±3%）、81%（±4%）和 82%（±4%）（图 11A、B）。相反，用 Pepstatin A 处理并经 HCl 激活的样本泳道强度没有显著变化（图 11B）。蛋白质免疫印迹分析显示，病毒 S 蛋白水平在激活后 1 分钟、5 分钟和 10 分钟分别显著下降约 90%（±7%）、99%（±1%）和 99%（±2%），N 蛋白水平在激活后 1 分钟、5 分钟和 10 分钟分别显著下降约 71%（±14%）、77%（±11%）和 78%（±11%）（图 10C-E），细胞 GAPDH 蛋白水平在激活后 1 分钟、5 分钟和 10 分钟分别显著下降约 99.5%（±0.5%）（图 11C、F）。相反，Pepstatin A 的存在几乎抑制了所有经 HCl 激活样本中的这种蛋白水解作用，只有在 10 分钟后细胞 GAPDH 蛋白水平有大约 9%（±6%）的下降，这可能是由于酸水解造成的。总体而言，这表明观察到的下降是由于天冬氨酸蛋白酶的活性，在 Pepstatin A 处理的样本中这种酶的活性被抑制，并且其激活需要低 pH 环境。

图11. 用 HCl 激活的埃及果蝠胃匀浆可消化 SARS-CoV-2 病毒粒子，但胃蛋白酶的蛋白水解作用可被 Pepstatin A 抑制。考马斯亮蓝染色的 SDS-PAGE 凝胶（A）和（B）中各泳道的密度分析，以相应的 H₂O 处理样本进行归一化。SARS-CoV-2 刺突蛋白和核衣壳蛋白、胃蛋白酶原 / 胃蛋白酶和 GAPDH 的 SDS-PAGE 凝胶的代表性蛋白质免疫印迹（C）。蛋白质免疫印迹的密度分析，以相应的 H₂O 处理样本进行归一化（D-F）。误差条表示三个独立实验的标准差（±SD）；p 值使用双向方差分析和 Tukey HSD 事后检验计算。无显著性差异（ns），（）p<0.05，（）p<0.01，（）p<0.001，（****）p<0.0001。

0504. SARS-CoV-2 对埃及果蝠胃中 HCl 的敏感性

接下来，研究人员检查了仅酸性 pH（研究人员发现其存在于埃及果蝠的胃中，补充图 S6）对 SARS-CoV-2 病毒粒子感染性的影响。因此，研究人员将病毒粒子暴露于约 pH 2.5 的环境中，这与胃蛋白酶实验中使用的 pH 值相同。仅暴露 1 分钟，然后进行酸中和，病毒感染性就急剧下降了约 4 个 Log₁₀，通过 TCID₅₀/mL 测量，在暴露 5 分钟后，病毒感染性降至 10¹.⁵ TCID₅₀/mL 的检测阈值以下（图 10G）。因此，胃蛋白酶介导的蛋白质降解和酸性环境可能共同降低了感染性。

四、讨论

基于冠状病毒在蝙蝠中普遍存在的胃肠道嗜性，以及表明菊头蝠属和牙买加果蝠的小肠上皮表达 ACE2 和 TMPRSS2 且易受 SARS-CoV-2 感染的研究，研究人员旨在分析埃及果蝠口服 SARS-CoV-2 感染的效率。研究人员之前使用相同蝙蝠物种进行的鼻内攻毒研究表明，该病毒可在上呼吸道短暂感染，但向接触动物的传播效率较低。鉴于金黄地鼠经口气管接种 SARS-CoV-2 比鼻内接种更易感，研究人员还纳入了经口气管接种途径，以评估该蝙蝠物种下呼吸道对 SARS-CoV-2 的易感性。

研究人员证实，在模拟感染的埃及果蝠的分析组织中，ACE2 以及在较小程度上 TMPRSS2 均有丰富表达，这证实了之前在该物种鼻甲中检测到 ACE2 表达的研究结果。最近的一项研究强调了 ACE2 和 TMPRSS2 表达的重要性，该研究表明这些因子在呼吸道中的分布与 SARS-CoV-2 的组织嗜性相关。在一些物种中，ACE2 和 TMPRSS2 mRNA 的高共表达与对 SARS-CoV-2 感染的更高易感性相关；而在其他物种中，这只是部分决定因素，表明在这些物种中还涉及其他宿主因子来促进病毒的感染。虽然作为病毒复制替代指标的 sgRNA 的检测，与大多数组织中 ACE2 和 TMPRSS2 mRNA 的组织分布和丰度具有良好的相关性，但研究人员并未在埃及果蝠的大脑中检测到这两种因子的丰富表达。鉴于在一只鼻内攻毒蝙蝠的大脑中检测到具有复制能力的病毒，这一结果令人惊讶，它支持了其他宿主因子可能共同影响 SARS-CoV-2 感染易感性的假设。同时，研究人员在很大程度上排除了 ACE2 和 TMPRSS2 表达缺失是胃肠道组织中病毒复制缺乏的原因。此外，鼻内或口服感染 SARS-CoV-2 的结果不一致，不太可能仅仅是由于 SARS-CoV-2 进入呼吸道和消化道细胞的能力差异造成的，而可能是由于一种尚未知晓的辅助因子，这需要进一步研究。

除了口服和经口气管低剂量攻毒的动物外，所有动物体重均增加，这很可能是由于与之前饲养在鸟舍中相比，在笼子里活动突然受到限制。由于在使用更高攻毒剂量的第二项研究中，动物没有出现初始体重下降，因此对于在第一项研究中观察到的令人困惑的短暂体重下降，必须假设其原因与攻毒本身无关。正如温度和运动活动数据（图 1 和图 2）所示，鼻内攻毒的动物体温略有升高但不显著，运动活动下降，而在第二项研究中没有出现这种情况。鉴于研究中每组动物数量总体较少，这在使用外来动物进行研究时是不可避免的，这些观察结果很可能是由于生物学差异造成的。在本研究中测量的体温值，落在之前报道的同一繁殖群体成员的昼夜变化范围内，即 34°C 至 41.5°C。

研究人员应用双标水（DLW）方法，测定了埃及果蝠在感染 SARS-CoV-2 后的前 48 小时内的每日能量消耗（DEE）。到目前为止，这种方法主要应用于野外研究以确定野外代谢率，研究人员之前也在感染 SARS-CoV-2 的地鼠中使用过该方法。因此，研究人员决定在本研究中也应用这种方法，以更好地了解埃及果蝠感染 SARS-CoV-2 后的代谢后果，在过去使用流感病毒和 SARS-CoV-2 进行的攻毒实验中，并未观察到该物种有任何感染的临床症状。尽管研究人员确实观察到不同接种途径和不同 SARS-CoV-2 剂量的接种组之间，在病毒学参数上存在明显差异，但 DLW 方法并未检测到各组之间在 DEE 或总水摄入量（TWI）测量值上有任何显著差异，无论感染途径和感染剂量如何。然而，研究人员能够表明，本研究中测定的 DEE 与之前报道的其他 11 种蝙蝠物种的总体 DEE 模式非常吻合（补充图 S3），因此研究人员得出结论，研究人员的数据是有效的。这一发现支持了蝙蝠通常比其他哺乳动物物种对病毒感染更具抵抗力的观点。然而，数据显示感染蝙蝠与未感染蝙蝠之间的变异性更高，这可能与使用活动记录器测定的总体较低运动活动有关。

在 10⁶ TCID₅₀攻毒实验中，口服攻毒的蝙蝠在夜间的运动活动水平仍然较低，而在白天较高，与鼻内攻毒的蝙蝠形成对比，鼻内攻毒的蝙蝠在白天和夜间的运动活动水平，均低于未感染和口服攻毒的蝙蝠。显然，口服攻毒的蝙蝠对感染的反应方式，与呼吸道攻毒的蝙蝠不同，这值得进一步研究。在本研究中，所有蝙蝠的体温曲线基本保持稳定，白天体温较低，夜间较高，这与低剂量实验略有不同，在低剂量实验中，口服攻毒的蝙蝠在夜间体温最低。同样，在任何攻毒蝙蝠中，都未观察到体温高于之前报道的生理变化范围，体温值均落在之前公布的该繁殖群体的昼夜变化范围内。研究人员观察到，与未感染蝙蝠相比，病毒攻毒蝙蝠在夜间的体温与运动活动的比值略有增加，而在未感染蝙蝠中，这两个参数是同时增加和减少的。之前有报道称，蝙蝠的运动活动，尤其是飞行时，会使体温升高，这表明它们之间存在内在联系。因此，观察到病毒攻毒蝙蝠中这种关系减弱，提供了一个新的见解，值得进一步研究，以确定较高的体温如何与较低的运动活动相关联，在之前对同一物种的研究中已经观察到这种现象。

由于研究中使用的一些蝙蝠意外怀孕，研究人员想要阐明在攻毒期间这种改变的生理和免疫状态，是否会改变蝙蝠对感染的反应。不同的野外研究报道称，怀孕蝙蝠的抗体水平以及亨尼帕病毒和丝状病毒的排出量明显更高。在本研究中，研究人员并未观察到如此明显的影响，尽管在怀孕动物中可以观察到 gRNA 的排出量略有增加。研究发现，怀孕会影响哺乳动物母亲的免疫状态。或者，研究中使用的动物来自圈养繁殖群体，这也可能起到一定作用，因为这些动物不会遭受食物短缺或特殊压力，使它们对怀孕或病毒感染等压力源更具抵抗力。

使用较低的攻毒剂量 10⁴ TCID₅₀时，鼻内和经口气管攻毒可诱导产生有效的感染，并排出具有复制能力的病毒。相反，埃及果蝠在口服攻毒后并未有效感染，因为这些动物仅排出低水平的 gRNA，且未排出 sgRNA 或具有复制能力的病毒。因此，尽管 β 冠状病毒通常对胃肠道具有嗜性，这一点已通过菊头蝠肠道上皮的易感性得到证实，但对埃及果蝠进行口服攻毒并不有效。虽然鼻内和经口气管攻毒（而非口服攻毒）会导致病毒 RNA 在粪便中大量排出，但这些蝙蝠胃肠道中病毒粒子的存在，不太可能是由于吞咽了感染性的呼吸道粘液分泌物。鉴于在整个胃肠道（小肠、结肠和肠系膜淋巴结）中都检测到了 gRNA 和 sgRNA，这些复制位点更有可能是病毒从呼吸系统全身传播所致病毒经呼吸道传播至全身，进而感染胃肠道组织并导致粪便排毒，这一结论得到了部分高感染剂量攻毒动物血清中检测到低水平病毒 gRNA 的支持。未来的研究应致力于明确病毒进入胃肠道的精确路径。

使用较高剂量 10⁶ TCID₅₀的 SARS-CoV-2 进行鼻内攻毒，再次诱导了有效的感染，病毒可传播至呼吸道和消化道。在口服攻毒的蝙蝠中，从接种后第 2 天到第 5 天，可检测到低水平的肛门和鼻腔病毒 RNA 排出，这可能是由于在口服接种时，少量病毒意外进入呼吸道，或者在口服攻毒后的最初几天内，蝙蝠摄入了受感染的分泌物。

在一只接种后第 2 天被处死的鼻内攻毒动物（FH 25）的脑组织中，通过三种独立方法（RT-PCR、病毒滴定和原位杂交）检测到 SARS-CoV-2，这一有趣的发现可能表明病毒通过血液传播。然而，对这一结果的解释应谨慎，需要后续研究来确定病毒进入大脑的途径。虽然嗅球被认为是 SARS-CoV-2 病毒粒子进入叙利亚地鼠大脑的常见入口，但在这只蝙蝠（FH 25）的案例中，鼻传播途径的可能性较小，因为在其嗅球中未检测到任何与 SARS-CoV-2 相关的病毒 RNA。在高度人工构建的 K18-ACE2 转基因小鼠 SARS-CoV-2 感染模型中，经常报道存在微血管损伤和血脑屏障受损的情况，并且有人认为在严重的人类病例和 K18-ACE2 转基因小鼠中，血脑屏障的破坏会导致病毒传播至中枢神经系统。在本案例中，通过 RT-PCR 分析证实脾脏也受到感染，这也支持了病毒通过血液传播的观点。

基于研究结果，研究人员推测埃及果蝠的感染途径如下：鼻内感染最为有效，因为病毒被注入到上呼吸道最易感的组织中，在那里病毒进行有限的繁殖，随后病毒全身传播，甚至可能导致中枢神经系统感染。经口气管接种到下呼吸道的效率明显较低，这与研究人员之前对金黄地鼠的研究结果相反，但病毒仍可能传播至其他器官系统，包括消化道。虽然鼻内和经口气管攻毒均可在鼻上皮中检测到 gRNA 和 sgRNA，但只有鼻内攻毒才能检测到具有复制能力的病毒。此外，在这些蝙蝠中，在气管（gRNA 和 sgRNA）和肺（仅在接种后第 4 天检测到 gRNA）中可检测到病毒 RNA，但未检测到具有复制能力的病毒。这表明 SARS-CoV-2 对该物种的上呼吸道具有强烈的嗜性，尽管已有研究表明埃及果蝠的上、下呼吸道以及胃和肠道中均大量表达 ACE2。相比之下，埃及果蝠对口服 SARS-CoV-2 接种不易感。

最近对牙买加果蝠（A. jamaicensis）的一项研究表明，鼻内接种 SARS-CoV-2 后，肺组织的易感性较低，但小肠会出现暂时感染。肺感染无效归因于 ACE2 表达水平较低，通过将人 ACE2 转导至肺细胞中，可成功克服这一问题。ACE2 同源物的氨基酸序列比对显示，埃及果蝠和牙买加果蝠的 ACE2 与人类 ACE2 的氨基酸同源性分别为 78.76% 和 79.5%。然而，当比较与 SARS-CoV-2 受体结合域（RBD）直接接触的 ACE2 氨基酸时，埃及果蝠和牙买加果蝠的同源性分别变为 83.33% 和 75%。这些差异可能导致埃及果蝠和牙买加果蝠对 SARS-CoV-2 的易感性和允许性存在差异。

此外，最近一项研究检测了表达 ACE2 的牙买加果蝠肠道类器官对 SARS-CoV-2 感染的易感性，结果支持小肠对病毒感染的易感性。该研究发现，这些类器官可以被感染，可检测到有限的病毒 gRNA 和 sgRNA，但未检测到感染性病毒，表明病毒复制受阻。这种有限的感染归因于类器官成功启动了抗病毒 IFN 反应，同时激活了保护和再生途径。这些以及其他已发表的观察结果表明，蝙蝠中的冠状病毒似乎对胃肠道组织具有嗜性，并通过粪便排出病毒。然而，研究结果表明，呼吸道感染后病毒全身传播会导致胃肠道组织感染和粪便排毒，因为口服摄入病毒似乎不太可能是传播方式。

进一步地，与之前使用牙买加果蝠肠道类器官的研究一致，在 10⁶ TCID₅₀攻毒实验（而非较低的 10⁴ TCID₅₀剂量实验）中，研究人员对蝙蝠免疫反应的分析检测到，口服攻毒蝙蝠的结肠在接种后第 2 天 IFNβ1 被诱导，而这也是研究人员检测到病毒 RNA（gRNA 和 sgRNA）的唯一器官组织。相比之下，中华菊头蝠的肠道类器官在感染 SARS-CoV-2 后，并未诱导 IFN-I 的表达。这种差异可能是由于实验条件不同（例如感染剂量）或所分析的蝙蝠物种不同。有趣的是，低剂量经口气管感染会触发肺淋巴结中 IFNβ1 和 CXCL10 的表达，这表明 SARS-CoV-2 从气管传播到了这些淋巴结。有趣的是，虽然研究人员在鼻内攻毒蝙蝠的结肠中检测到了类似的病毒 RNA 水平，但这些蝙蝠并未显示出类似的 IFNβ1 诱导。有人推测，在 10⁶ TCID₅₀攻毒实验中，口服接种蝙蝠结肠中 IFNβ1 的诱导可能会导致干扰素信号介导的疲劳，从而导致运动活性降低。然而，鉴于蝙蝠的免疫反应与其他哺乳动物相比具有独特性，例如在 RNA 病毒感染后限制炎症细胞因子的表达，这种情况可能并非如此。

为了解决为什么口服接种未导致有效感染的问题，研究人员测定了埃及果蝠胃和肠道的 pH 值。之前的研究发现蝙蝠胃的生理学存在差异，突出了食虫蝙蝠和食果蝙蝠之间的显著差异，食果蝙蝠拥有更多产生胃蛋白酶原的主细胞和产生酸的壁细胞。从机制上讲，天冬氨酸蛋白酶胃蛋白酶在蝙蝠胃中消化摄入的蛋白质。它最初以无活性的酶原胃蛋白酶原的形式合成并分泌到胃腔中。在 HCl 存在的情况下（伴随 pH 值降至 5 以下），胃蛋白酶原转化为其活性形式胃蛋白酶。胃蛋白酶在 pH 1.8 至 3.5 时活性最佳，在 pH 5 时可逆失活，在 pH 7 时不可逆变性。

研究表明，在食果的埃及果蝠中，胃同样呈酸性，胃蛋白酶原向胃蛋白酶的转化及其活性依赖于酸性环境。研究人员对埃及果蝠胃肠道 pH 值的测量结果，与另一种食果蝙蝠（C. perspicillata）公布的 pH 值范围相符。此外，研究人员还表明 SARS-CoV-2 病毒粒子易受胃蛋白酶介导的蛋白水解降解作用。研究人员还发现，仅低 pH 值就能显著降低病毒粒子的感染性。因此，胃蛋白酶介导的蛋白质降解和酸性条件可能共同降低了病毒的感染性。因此，在使用低剂量 10⁴ TCID₅₀攻毒时，酸性环境和胃蛋白酶介导的降解作用能够阻止感染，即使使用高剂量 10⁶ TCID₅₀攻毒，也不足以完全克服这一障碍。然而，该剂量足以使结肠上皮发生短暂感染，这通过检测到 gRNA 和 sgRNA 得以证实。

本研究的一个局限性是每组动物数量较少，在高防护条件下使用外来动物进行研究时，这是不可避免的。这在一定程度上阻碍了统计分析，尤其是对生理数据（体温和活动）的分析，但它仍然使研究人员能够观察到某些趋势，这些趋势可作为未来研究的基础。

五、结论

总之，研究人员发现埃及果蝠在鼻内接种低至 10⁴ TCID₅₀的 SARS-CoV-2 后，对病毒感染具有易感性，且病毒主要嗜染上呼吸道。相反，埃及果蝠对口服 SARS-CoV-2 攻毒不易感，研究人员认为这是由于胃起到了屏障作用，不过较高的感染剂量可能会部分克服这一屏障。研究人员还发现，在鼻内或经口气管接种后，埃及果蝠可能在口腔和肛门拭子中携带极低水平的具有复制能力的 SARS-CoV-2 病毒，这些病毒是从呼吸道传播而来的。虽然感染动物理论上可能会将病毒传播给家畜、宠物或人类，但考虑到感染的短暂性以及之前研究和本研究中报道的低水平病毒排出情况，埃及果蝠即使感染，在野外也不太可能成为 SARS-CoV-2 的有效自然宿主。此外，研究人员通过检测病毒排出、组织分布、生理反应、免疫反应以及代谢过程来研究埃及果蝠 SARS-CoV-2 感染的方法，使研究人员能够发现动物对口服攻毒的隐藏反应，否则这些反应很容易被完全忽略。这种广泛的方法可作为研究蝙蝠其他病毒感染的模型，特别是在仅观察到短暂感染且病毒传播过程细节未知的情况下。

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